WB实验流程和注意事项@清泓生物

生命的新陈代谢和功能调控主要由蛋白质分子完成。解密蛋白质功能是研究生命科学，治疗疾病的重要基础。 WB（Western blot）是研究蛋白分子，蛋白表达水平和蛋白修饰的重要研究方法。WB利用聚丙烯酰胺电泳分离 蛋白，利用特异性抗原抗体反应识别目的蛋白，从而实现对蛋白自身功能及其相关蛋白功能的研究。

1.1 根据实验设计，检测样品可能是组织样品，也可能是细胞样品，不同样品制备流程不太相同，目的蛋白表 达量也有较大差别。

1.2 根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体（一抗）和酶标二抗：抗体有单克隆抗体和多克隆抗体；不同的 抗体用不同抗原制备，抗原有的是全长蛋白，有点是较短的肽段，有点是含磷酸化的氨基酸残基，对应的 检测目的也不同；不同抗体的灵敏性和特异性不相同，根据文献和目的蛋白表达量选择合适抗体。根据一 抗性质选择对应的酶标二抗，部分抗体到货周期较长，需要提前2-4周订货。

1.3 必须选择和准备针对一抗的WB（+）对照样品。

1.4 根据蛋白分子量选择合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度，合适的蛋白marker，以及转膜条件等具体实验条件。

1.5 根据实验目的设计合理的样品上样顺序，预留蛋白marker位置和一抗（+）对照样品位置。空置的加样孔补 入等体积的空白1×SDS样品缓冲液。

1.6 实验前确认WB平台稳定，仪器设备正常工作，试剂耗材有足量库存。

2.1.1 细胞样品制备-1：离心收集目的细胞，用适量体积PBS均匀重悬细胞，加入等体积2xSDS-PAGE loading buffer，最终细胞浓度不低于2E4细胞/μL。用三氯乙酸沉淀蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度。

2.1.2 细胞样品制备-2：离心收集目的细胞，根据实验目的选择适合试剂盒抽提细胞总蛋白，核蛋白或者膜蛋白。 具体流程参照试剂盒说明书。用BCA法或者Bradford法测定蛋白浓度。

2.1.3 组织样品准备：根据实验目的不同，可以选取组织蛋白抽提试剂盒，参照试剂盒说明书操作。称量组织重 量，加入组织裂解液后用高速组织匀浆器裂解细胞抽提组织总蛋白。用BCA法或者Bradford法测定蛋白浓 度。

2.2.1 将一块有0.75mm垫片的玻璃和无垫片的平板玻璃组装玻璃平板夹层，固定在灌胶支架上。

2.2.2 加入蒸馏水3ml对固定平板进行检漏，如有漏水则重新安装，确保无漏液后继续实验。

2.2.3 根据需要的浓度配制分离胶，加入适量的水、Tris buffer、丙烯酰胺溶液，再加入10%的过硫酸铵和TEMED， 轻轻搅拌混匀后轻轻沿玻璃平板边缘加入至凝胶约5cm高为止。

2.2.4 在液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇，让凝胶在室温聚合30 min。聚合后，在异丁醇与凝胶的界面间可 见一条清晰的折光线。

2.2.5 弃异丁醇，用1×Tris-Cl/SDS，pH 8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面，用滤纸片吸干残留水分。

2.2.6 配制积层胶溶液，将液体沿一侧垫片轻轻加入分离胶上方，至玻璃平板顶部。迅速轻柔地将0.75 mm厚的 梳子插入积层胶液体。必要时可补加积层胶液体填充无胶液空间。让积层胶在室温聚合30 min。

2.2.7 按电泳系统厂商说明书将凝胶板固定到电泳装置，上下槽各加入适量1×SDS电泳缓冲液。

2.2.8 小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。保证上槽的电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔。

2.2.9 根据实验设计进行蛋白上样。

2.2.10 连接电源，80V恒压电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，120V恒压继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。

2.2.11 关闭电源，取出胶板备后续转膜用。

2.3.1 提前准备PVDF膜和滤纸。将PVDF膜裁至合适大小，在甲醇中浸泡10min，然后泡入1x转膜缓冲液中备 用。

2.3.2 在一浅盘容器中加入适量1x转膜缓冲液。

2.3.3 小心橇起凝胶上面的玻璃平板，暴露凝胶，轻轻切断凝胶和玻板的连接，将凝胶小心从玻板上剥落入放有 1x转膜缓冲液的浅盘中。

2.3.4 依次将2张滤纸、SDS-PAGE胶、膜、2张滤纸叠放在一起，对齐并赶出其中的气泡，一起装入转膜夹中。

2.3.5 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极)。

2.3.6 接通电源，在4℃冰浴中进行转膜，恒流300毫安（或恒压100伏）转膜>1hr。

2.3.7 断开电源并拔下插头，取出转移夹，去滤纸，检查凝胶和膜上预染marker，观察和记录转膜效果。

2.3.8 标记膜的左下角，继续后续实验步骤。

2.4.1 将转好的膜浸于5％脱脂奶粉中封闭1小时。

2.4.2 用TBST将膜浸洗2次，5 min/次。

2.4.3 将膜浸于含有合适稀释度的一抗中，室温结合1小时以上或者4度结合过夜。

2.4.4 用TBST将膜浸洗3次，5 min/次。

2.4.5 将膜浸于含有合适稀释度的二抗中，室温结合1小时以上。

2.4.6 用TBST将膜浸洗3次，5 min/次，膜即可用于显色反应。

2.5.1 将膜表面的液体沥干，置于干净的保鲜膜上。

2.5.2 将等体积的底物1和底物2混合（常规用量为10μl/cm2膜）后，均匀覆盖于膜的表面，避光放置3-5min。

2.5.3 将膜表面的液体沥干，用干净的保鲜膜包裹，固定于暗盒，在暗室中压X光片，压片时间根据发光信号强 度调节。

2.5.4 显影，定影，标记X光片，分析实验结果。

4.1 实验操作细心和沉稳，避免慌乱中出错。

4.2 蛋白样品制备遵循正确流程，电泳上样前99度加热5min。

4.3 电泳制胶避免失误，电源接头不能装反。

4.4 转膜过程中特别注意膜和胶的位置，转膜方向不能反。

4.5 抗体稀释度摸索合适条件，尽量提高信噪比。

4.6 保证试剂配制正确，实验系统稳定，实验中必须含（+）对照。